1. 2009년 H1N1형 influenza virus에 대한 마우스 병원성주 생산
질병관리본부에서 제공한 wild type의 H1N1 pandemic 2009-A/korea/2785/2009 인플루엔자 바이러
스를 사용하여 마우스에서 병원성을 보이는 인플루엔자 바이러스를 만들기 위해서 ㈜오리엔트바이오
에서 구입한 inbred mouse 5종(Balb/c, C57BL/6, C3H, DBA/1J, DBA/2N)을 대상으로 실험을 수행
하였다.
5종의 inbred mouse에 2일 간격으로 반복적인 lung-to-lung passage 결과, Balb/c, DBA/1J,
DBA/2N 3종에서 폐사율 증가 및 폐사기간 단축에서 의미가 있는 mouse pathogenicity를 1차로 확
인하였다. Balb/c에서 얻어진 15, 26 passage와 DBA/1J에서 얻은 13, 19 passage의 lung
homogenate를 이용하여 plaque assay 및 plaque purification을 통해 각 passage당 5 clone 씩 총 20
clone을 분리하였고 이를 MDCK 세포주에 감염시켜 마우스 병원성 바이러스를 확보하였다. Balb/c
에 감염시킨 경우 10개 virus clone 중에서 6개 (15-1, 15-4, 15-6, 26-1, 26-4 및 26-5)의 virus
clone이 1차 분석결과 높은 mouse pathogenicity를 보이는 것으로 확인되었으며 이중에서 4개
(15-1, 15-4, 26-1 및 26-4)의 virus clone을 선택하여 재 검증을 실시하였다. 또한, DBA/1J mouse
에 감염시킨 경우 10개 virus clone 중에서 7개 (13-1, 13-3, 13-4, 19-1, 19-3, 19-4 및 19-5)의
virus clone이 1차 분석결과 높은 mouse pathogenicity를 보이는 것으로 확인되었으며 이중에서 5개
(13-1, 13-3, 19-1, 19-3 및 19-5)의 virus clone을 선택하여 역시 재 검증을 실시하였다.
결론적으로, Balb/c에서 15-1, 26-1의 virus clone들과 DBA/1J에서 13-1, 13-3, 19-3 및 19-5의
virus clone들을 최종 선정하였으며 상기 바이러스 주들은 “질병관리본부 인플루엔자 바이러스과”에
제공하였다. 유전자 서열분석 및 병원성 분석시험을 위해서 Balb/c_15-1 과 DBA/1J_13-3 virus
clone을 선택하여 사용하였다.
2. 유전자 서열 정보 분석
Balb/c_15-1 및 DBA/1J_13-3 virus clone을 가지고 RNA 추출, cDNA 합성 및 각 유전자에
specific primer를 이용한 PCR product를 생성하였고 8개 유전자에 대해 모두 염기서열 분석을 완료
하였다.
국내 최초 H1N1pdm09 분리주 (KR01)와 Balb/c_15-1 유래 H1N1 virus를 가지고 비교한 경우 8개
viral protein에서 총 15개의 아미노산 치환이 일어남을 확인하였고, 이중에 PA (2개), HA (4개), NP
(2개) 그리고 NA (4개)의 viral protein에서 대부분의 변이가 관찰되었다. 또한, DBA/1J_13-3 유래
H1N1 virus의 경우에는 8개 viral protein에서 총 16개의 아미노산 치환가 일어남을 확인하였으며,
이중에 PA (3개), HA (4개) 그리고 NA (5개)의 viral protein에서 대부분의 변이가 관찰되었다.
특히, 인플루엔자 바이러스의 virulence와 host range에 주된 영향을 미치는 hemagglutinin (HA)에
서 많은 아미노산의 치환이 일어났음이 확인되었으며, 아미노산 치환 위치는 서로 다른 부분에서 발
생하였으나 변이빈도는 기존의 선행연구에서 보고된 연구결과와 매우 유사함을 확인하였다. 동시에
인플루엔자 바이러스의 다른 7개 viral protein에서의 아미노산 치환 정도도 매우 유사한 것으로 확
인되었다. 본 연구에서 특징적인 것은 Balb/c_15-1 과 DBA/1J_13-3 유래 H1N1 virus 모두 HA
glycoprotein에서의 아미노산 치환은 동일한 위치에서 동일한 아미노산으로의 치환된 것으로 미루어
아마도 이러한 변이가 두 실험동물의 virulence에 보다 많은 부분에서 기여한 것으로 생각된다.