항생제 감수성 시험은 시험 균주의 오염, 부정확한 탁도 및 균주의 활성도 등에 따라 결과의 정확성이 떨어질 가능성이 있다. 따라서 매 시험마다 정확한 정도관리균주를 포함하여 시험하고, 정도관리 균주의 결과를 가장 먼저 확인한다. 정도관리 균주(51-53쪽 참조)의 결과가 허용 범위를 벗어난 경우는 해당 시험 결과를 신뢰할 수 없으므로 재실험을 시행한다.

• 16-24시간 순배양된 집락 사용
• 항생제 감수성 시험에 사용하는 세균은 반드시 순수 배양된 집락을 사용해야 하며, 16-24시간 배양한 집락을 이용한다.
• 항생제 감수성 시험용 배지의 관리
• 항생제 감수성에 사용하는 배지는 구입 후에 반드시 정도관리를 시행

감수성 시험 대상인 항생제는 다음의 원칙에 따라 선택하였다.

5-15-15 규칙 준수

• 정확한 항균제 감수성 시험을 위해서는 15-15-15 규칙을 준수한다.
• 균액 제조 후 15분 이내 배지 접종-배지 접종 후 15분 이내 디스크 접종-디스크 접종 후 15분 이내 배양 시작)

1. 시험방법
   • 가) 세균 부유액 준비
     • ① 시험할 집락을 멸균 식염수(saline)에 접종 (반드시 1개의 집락만을 선택하여 시험하고, 집락의 크기가 작아서 부득이한 경우는 최대한 동일 형태의 집락을 선택)
     • ② 식염수를 써서 균액의 탁도를 McFarland의 0.5에 맞춘다(표준 탁도시험관 비교 또는 탁도계 사용).
   • 나) 배지
     • 배지는 시험 항생제의 숫자에 따라 Mueller-Hinton 한천배지 90 mm와 150 mm 크기를 사용한다. 배지의 두께는 중심부부터 가장 자리까지 4 mm로 일정하게 유지되어야 한다.
   • 다) 접종
     • 면봉에 균액을 묻히고 과량의 액체는 면봉을 시험관 벽에 대고 돌려 제거한 후에 접종한다(균액을 만들고 15분 이내에 접종). 균액은 배지를 120°씩 돌려서 3번을 바르도록 한다.
   • 라) 디스크 놓기 (Applicator 사용)
     • 균액을 접종하고 3-5분 후에 물기가 마르면 디스크를 놓고, 떨어진 디스크는 이동을 금지한다(균액 접종 후 15분 이내에 항생제 디스크 접종).
   • 마) 디스크까지 접종한 배지는 15분 이내에 배양기에 넣고 35℃에 16-18시간 배양 한다(Vancomycin은 24시간 배양).
     

     | Figure Ⅳ-2 | 균액 접종방법 및 버어니어 캘리퍼스

     
     

     | Figure Ⅳ-2 | One Health 항생제 내성균 연구 대상 항생제 및 시험 방법

     항생제 감수성시험법중 One Health 항생제 내성균 연구 대상 항생제 Antibiotics별 SA, SE, SI, EF, EM, EC, KP, CI, EN, PA, AB, SL, SH, CA 시험 방법 정보 표

     Antibiotics	SA	SE	SI	EF	EM	EC	KP	CI	EN	PA	AB	SL	SH	CA1
     Penicillin	D	D	D	D
     Oxacillin			D
     Ampicillin				D	D	D						BD	BD
     Piperacillin						D	D	D	D	D	D
     Amoxicillin-clavulanic acid						D	D	D	D
     Ampicillin-sulbactam						D	D	D			D
     Piperacillin-Tazobactam										D
     Cefazolin						D	D	D
     Cefotaxime						D	D	D	D			BD	BD
     Ceftriaxone												BD	BD
     Ceftazidime						D	D	D	D	D	D	BD	BD
     Cefepime						D	D	D	D	D	D
     Cefoxitin	D	D				D	D	D				BD	BD
     Aztreonam						D	D	D	D
     Ertapenem						D	D	D	D
     Imipenem						D, AD	D, AD	D, AD	D, AD	D	D	BD	BD
     Meropenem						D, AD	D, AD	D, AD	D, AD	D	D
     Erythromycin	D	D	D											D
     Azithromycin												BD	BD
     Clindamycin	D	D	D
     Quinupristin-dalfopristin	D	D	D		D
     Amikacin						D	D	D	D	D	D	BD	BD
     Gentamicin	D	D	D			D	D	D	D	D	D	BD	BD
     Streptomycin												BD	BD
     Tobramycin						D	D	D	D	D	D
     Gentamicin-High Level				D	D
     Streptomycin-High Level				D	D
     Ciprofloxacin				D	D	D	D	D	D	D	D	BD	BD	D
     Nalidixic acid						D	D	D	D			BD	BD
     Tetracycline	D	D	D	D	D	D	D	D	D		D	BD	BD	D
     Minocycline											D
     Tigecycline	E	E	E	E	E	D	D	D	D		D
     Vancomycin	E	E	E	E	E
     Teicoplanin	E	E	E	E	E
     Trimethoprime- sulfamethoxazole	D	D	D			D	D	D	D			BD	BD
     Mupirocin	D	D	D
     Linezolid	E	E	E	E	E
     Chloramphenicol	D	D	D	D	D	D	D	D	D			BD	BD
     Nitrofurantoin				D	D	D	D	D	D
     Rifampicin	D	D	D
     Colistin						BD	BD	BD	BD	BD	BD	BD	BD

     출처

     * Abbreviations: AD, agar dilution method; BD, broth microdilution method; D, Disk diffusion method; E, Etest; SA, S. aureus; SE, S. epidermidis; SI, S. pseudintermedius; EF, E. faecalis; EM, E. faecium; EC, E. coli; KP, K. pneumoniae; CI, Citrobacter spp.; EN, Enterobacter spp.; PA, P. aeruginosa; AB, Acinetobacter spp.; SL, Salmonella spp.; SH, Shigella spp.; CA, Campylobacter spp.

     *** 위첨자1 1 Campylobacter 균종은 Blood MHA 배지를 사용하여 O2 5%, CO2 10%, N2 85% 환경에서 42°C 24시간 배양

2. 판독
   • 가) Biomic 장비 또는 버어니아 캘리퍼스를 이용하여 판독하며, 정도관리 균주부터 우선적으로 결과를 점검한다. 시험관리가 실패한 경우는, 원인을 규명하고 해결한 후에 해당 시기의 감수성 시험을 재시험한다.
   • 나) 30cm 떨어져서 육안으로 보아 증식이 완전히 억제된 곳까지의 지름을 재는 것이 원칙이지만 cotrimoxazole 및 linezolid 등은 증식이 80% 및 90% 억제된 곳까지 측정한다. Vancomycin은 억제대 모양과 억제대 내부의 집락을 주의 깊게 관찰한다.
     
     • a) 시험할 집락을 멸균 식염수(saline)에 접종 (반드시 1개의 집락만을 선택하여 시험하고, 집락의 크기가 작아서 부득이한 경우는 최대한 동일 형태의 집락을 선택)
     • b-d) 식염수를 써서 균액의 탁도를 McFarland의 0.5에 맞춘다(표준 탁도시험관 비교 또는 탁도계 사용).
   • 다) Biomic 장비 또는 이에 준하는 장비로 판독한 경우는, 장비에서 설정한 억제대의 지름이 정확한 지 여부를 육안으로 확인한 후에 결과를 저장한다. 장비에서 설정한 억제대 지름이 틀렸을 경우는 매뉴얼 기능을 사용하여 억제대 지름을 재설정한 후에 결과를 판독한다. 판독이 끝난 평판배지의 사진을 재해석에 대비하여 모두 장비에 저장하고, 매달 별도의 매체에 백업한다(외장 하드디스크 또는 DVD).
   • 라) Biomic 장비 또는 이에 준하는 장비로 판독한 경우에 소숫점 이하의 결과가 나오는 경우는 반올림 또는 반내림을 시행하여 결과를 해석한다. 억제대가 보이지 않는 경우는 6 mm로 결과를 입력한다.
3. 디스크 확산법 검사시 주의사항
   • 가) 감수성 검사의 결과는 여러 가지 요소에 의해 달라지므로 원법에 충실히 따르도록 한다.
   • 나) 냉동된 병에서 디스크를 꺼낼 때는 유효기간이 가까운 것부터 사용
   • 다) 항생제 디스크를 꺼내고 나서는 병마개를 꼭 막아서 습기 방지 (흡습제)
   • 라) 사용 중인 디스크는 용기에 넣고 뚜껑을 닫아서 습기 방지
   • 마) 사용 중인 디스크가 시험관리 범위를 벗어나면 즉시 보고
   • 바) 같은 세균이라고 확신할 경우가 아니면 여러 집락을 섞어서 시험하지 말 것
4. 균종별 시험항생제 및 판독기준

   균종별로 적용 가능한 판독 기준은 미국의 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M100-S27 Peformance standards for antimicrobial susceptibility testing (2017)을 적용하였고, 판독 기준이 없는 일부 항균제는 유럽의 The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 7.1, (2017)을 적용하였다 (EUCAST 표시). S. epidermidis 및 S. pseudintermedius의 mupirocin 판독기준은 EUCAST의 S. aureus 기준을 적용하였다.

   항생제 감수성시험법중 디스크 확산법의 균종별 시험항생제, 용량에 따른 판독기준 정보 표

   균종	항생제	용량(µg)	판독기준(mm)
   			≥S	I	≤R
   S. aureus	Penicillin	10U	29		28
   	Cefoxitin	30	22		21
   	Erythromycin	15	23	14-22	13
   	Clindamycin	2	21	15-20	14
   	Trimethoprim-sulfamethoxazole	1.25/23.75	16	11-15	10
   	Quinuprisitn-dalfopristin	15	19	16-18	15
   	Tetracycline	30	19	15-18	14
   	Mupirocin (EUCAST)	200	30	18-29	17
   	Cholramphenicol	30	18	13-17	12
   	Rifampicin	5	20	17-19	16
   S. epidermidis	Penicillin	10U	29		28
   	Cefoxitin	1	25		24
   	Erythromycin	15	23	14-22	13
   	Clindamycin	2	21	15-20	14
   	Trimethoprim-sulfamethoxazole	1.25/23.75	16	11-15	10
   	Quinuprisitn-dalfopristin	15	19	16-18	15
   	Tetracycline	30	19	15-18	14
   	Mupirocin (EUCAST)	200	30	18-29	17
   	Cholramphenicol	30	18	13-17	12
   	Rifampicin	5	20	17-19	16
   S. pseudintermedius	Penicillin	10U	29		28
   	Oxacillin	30	18		17
   	Erythromycin	15	23	14-22	13
   	Clindamycin	2	21	15-20	14
   	Trimethoprim-sulfamethoxazole	1.25/23.75	16	11-15	10
   	Quinuprisitn-dalfopristin	15	19	16-18	15
   	Tetracycline	30	19	15-18	14
   	Mupirocin (EUCAST)	200	30	18-29	17
   	Cholramphenicol	30	18	13-17	12
   	Rifampicin	5	20	17-19	16
   E. faecium	Penicillin	10U	15		14
   	Ampicillin	10	17		16
   	Gentamicin (High level)	120	10	7-9	6
   	Streptomycin (High level)	300	10	7-9	6
   	Ciprofloxacin	5	21	16-20	15
   	Tetracycline	30	19	15-18	14
   	Cholramphenicol	30	18	13-17	12
   	Nitrofurantoin	300	17	15-16	14
   E. faecalis	Ampicillin	10	17		16
   	Gentamicin (High level)	120	10	7-9	6
   	Streptomycin (High level)	300	10	7-9	6
   	Ciprofloxacin	5	21	16-20	15
   	Tetracycline	30	19	15-18	14
   	Quinuprisitn-dalfopristin	15	19	16-18	15
   	Cholramphenicol	30	18	13-17	12
   	Nitrofurantoin	300	17	15-16	14
   E. coli	Ampicillin	10	17	14-16	13
   	Piperacillin	100	21	18-20	17
   	Ampicillin-sulbactam	10/10	15	12-14	11
   	Amoxillin-clavulanate	20/10	18	14-17	13
   	Cefazolin	30	23	20-22	19
   	Cefotaxime	30	26	23-25	22
   	Ceftazidime	30	21	18-20	17
   	Cefepime	30	25	19-24	18
   	Aztreonam	30	21	18-20	17
   	Cefoxitin	30	18	15-17	14
   	Imipenem	10	23	20-22	19
   	Meropenem	10	23	20-22	19
   	Ertapenem	10	22	19-21	18
   	Amikacin	30	17	15-16	14
   	Gentamicin	10	15	13-14	12
   	Ciprofloxacin	5	21	16-20	15
   	Naldixic acdi	30	19	14-18	13
   	Trimethoprim-sulfamethoxazole	1.25/23.75	16	11-15	10
   	Tetracycline	30	15	12-14	11
   	Tigecycline (EUCAST)	15	18	17-15	14
   	Chloramphenicol	30	18	13-17	12
   	Nitrofurantoin	300	17	15-16	14
   K. pneumoniae	Piperacillin	100	21	18-20	17
   	Ampicillin-sulbactam	10/10	15	12-14	11
   	Amoxillin-clavulanate	20/10	18	14-17	13
   	Cefazolin	30	23	20-22	19
   	Cefotaxime	30	26	23-25	22
   	Ceftazidime	30	21	18-20	17
   	Cefepime	30	25	19-24	18
   	Aztreonam	30	21	18-20	17
   	Cefoxitin	30	18	15-17	14
   	Imipenem	10	23	20-22	19
   	Meropenem	10	23	20-22	19
   	Ertapenem	10	22	19-21	18
   	Amikacin	30	17	15-16	14
   	Gentamicin	10	15	13-14	12
   	Ciprofloxacin	5	21	16-20	15
   	Naldixic acdi	30	19	14-18	13
   	Trimethoprim-sulfamethoxazole	1.25/23.75	16	11-15	10
   	Tetracycline	30	15	12-14	11
   	Tigecycline (EUCAST)	15	18	17-15	14
   	Chloramphenicol	30	18	13-17	12
   	Nitrofurantoin	300	17	15-16	14
   Citrobacter spp.	Piperacillin	100	21	18-20	17
   	Ampicillin-sulbactam(C. freundii 자연내성)	10/10	15	12-14	11
   	Amoxillin-clavulanate	20/10	18	14-17	13
   	Cefazolin	30	23	20-22	19
   	Cefotaxime	30	26	23-25	22
   	Ceftazidime	30	21	18-20	17
   	Cefepime	30	25	19-24	18
   	Aztreonam	30	21	18-20	17
   	Cefoxitin	30	18	15-17	14
   	Imipenem	10	23	20-22	19
   	Meropenem	10	23	20-22	19
   	Ertapenem	10	22	19-21	18
   	Amikacin	30	17	15-16	14
   	Gentamicin	10	15	13-14	12
   	Ciprofloxacin	5	21	16-20	15
   	Naldixic acdi	30	19	14-18	13
   	Trimethoprim-sulfamethoxazole	1.25/23.75	16	11-15	10
   	Tetracycline	30	15	12-14	11
   	Tigecycline (EUCAST)	15	18	17-15	14
   	Chloramphenicol	30	18	13-17	12
   	Nitrofurantoin	300	17	15-16	14
   Enterobacter spp.	Piperacillin	100	21	18-20	17
   	Amoxillin-clavulanate	20/10	18	14-17	13
   	Cefotaxime	30	26	23-25	22
   	Ceftazidime	30	21	18-20	17
   	Cefepime	30	25	19-24	18
   	Aztreonam	30	21	18-20	17
   	Imipenem	10	23	20-22	19
   	Meropenem	10	23	20-22	19
   	Ertapenem	10	22	19-21	18
   	Amikacin	30	17	15-16	14
   	Gentamicin	10	15	13-14	12
   	Ciprofloxacin	5	21	16-20	15
   	Naldixic acdi	30	19	14-18	13
   	Trimethoprim-sulfamethoxazole	1.25/23.75	16	11-15	10
   	Tetracycline	30	15	12-14	11
   	Tigecycline (EUCAST)	15	18	17-15	14
   	Chloramphenicol	30	18	13-17	12
   	Nitrofurantoin	300	17	15-16	14
   P. aeruginosa	Piperacillin	100	21	15-20	14
   	Piperacillin-tazobactam	100/10	21	15-20	14
   	Ceftazidime	30	18	15-17	14
   	Cefepime	30	18	15-17	14
   	Imipenem	10	19	16-18	15
   	Meropenem	10	19	16-18	15
   	Amikacin	30	17	15-16	14
   	Gentamicin	10	15	13-14	12
   	Tobramycin	10	15	13-14	12
   	Ciprofloxacin	5	21	16-20	15
   Acinetobacter spp.	Piperacillin	100	21	18-20	17
   	Ampicillin-sulbactam	10/10	15	12-14	11
   	Ceftazidime	30	18	15-17	14
   	Cefepime	30	18	15-17	14
   	Imipenem	10	22	19-21	18
   	Meropenem	10	18	15-17	14
   	Amikacin	30	17	15-16	14
   	Gentamicin	10	15	13-14	12
   	Tobramycin	10	15	13-14	12
   	Ciprofloxacin	5	21	16-20	15
   	Tetracycline	30	15	12-14	11
   	Minocycline	30	16	13-15	12
   	Tigecycline (EUCAST)	15	18	17-15	14
   Campylobacterspp.	Erythromycin	15	16	13-15	12
   	Ciprofloxacin	5	24	21-23	20
   	Tetracycline	30	26	23-25	22

1. 시험방법 : 디스크확산법과 동일
   • 가)세균 부유액 준비
     • ① 시험할 집락을 식염수 (saline)에 접종 (반드시 1개의 집락만을 선택하여 시험하고, 집락의 크기가 작아서 부득이한 경우는 최대한 동일 형태의 집락을 선택)
     • ② 식염수를 써서 균액의 탁도를 McFarland의 0.5에 맞춘다(표준 탁도시험관 비교 또는 탁도계 사용).
   • 나) 배지

     시험 항생제의 숫자에 따라 Mueller-Hinton 한천배지 90mm와 150mm 크기를 사용한다. 배지의 두께는 중심부부터 가장 자리까지 4mm로 일정하게 유지되어야 한다.

   • 다) 접종

     면봉에 균액을 묻히고 과량의 액체는 면봉을 시험관 벽에 대고 돌리어 짜낸 후에 접종한다 (균액을 만들고 15분 이내에 접종). 균액은 배지를 120°씩 돌려서 3번을 바르도록 한다.

   • 라) Etest 스트립 놓기

     균액을 접종하고 3-5분 후에 물기가 마르면 스트립을 놓고, 떨어진 스트립은 이동을 금지한다(균액 접종 후 15분 이내에 스트립 접종).

   • 마) 스트립까지 접종한 배지는 15분 이내에 배양기에 넣고 35℃에 16-18시간 배양한다(Vancomycin은 24시간 배양).
2. 판독
   • 가)항생제 스트립과 억제대가 만나는 지점의 농도를 최소억제농도로 판정하며, 2개의 농도 사이에 억제대가 있으면 높은 농도로 판독한다.
     
   • 나) Linezolid, tigecycline 같은 bacteriostatic antibiotic은 증식 억제가 처음 관찰되는 80% 또는 90% 억제대를 판독한다.
     
   • 다) 억제대 안에 집락이 있으면 집락이 있는 지점까지 농도를 올려서 판독한다.
     
   • 라) 좌우의 농도가 다른 경우는 높은 농도로 판독하고 2단계 이상 차이나는 경우는 재시험한다.
     
   • 마) 용혈이 있는 경우는 용혈대를 판독하지 않도록 주의한다.
     
   • 바) Vancomycin과 teicoplanin의 경우에 타원형의 골짜기 억제대가 생기는 경우는 가장 낮은 억제대 농도를 판독한다.
     
3. 균종별 시험항생제 및 판독기준

   항생제 감수성시험법 중 ETest 균종별 시험항생제, 용량에 따른 판독기준 정보 표

   균종	항생제	판독기준(µg/mL)
   		≥S	I	≤R
   S. aureus	Vancomycin	2	4-8	16
   	Teicoplanin	8	16	32
   	Linezolid	4	NA	8
   	Tigecycline (EUCAST, BMD)	0.5	NA	1
   S. epidermidisS. pseudintermedius	Vancomycin	4	8-16	32
   	Teicoplanin	8	16	32
   	Linezolid	4	NA	8
   	Tigecycline (EUCAST, BMD)	0.5	NA	1
   E. faeciumE. faecalis	Vancomycin (24hr incubation)	4	8-16	32
   	Teicoplanin	8	16	32
   	Linezolid	2	4	8
   	Tigecycline (EUCAST, BMD)	0.25	0.5	1

1. 시험방법
   • 가) Salmonella 균종과 Shigella 균종의 항생제 감수성을 위해서는 주관 부서와 협의하여 국립보건연구원에서 사용 중인 Sensititre (Thermo-Fisher Scientific, USA)의 항생제 감수성 검사 패널을 사용한다.
   • 나) 시험할 집락을 식염수(saline)에 접종 (반드시 1개의 집락만을 선택하여 시험하고, 집락의 크기가 작아서 부득이한 경우는 최대한 동일 형태의 집락을 선택)하고, 식염수를 써서 균액의 탁도를 McFarland의 0.5에 맞춘다(표준 탁도시험관 비교 또는 탁도계 사용).
   • 다) 패널에 균액을 희석하여 well 당 5 X 105 CFU/mL이 되도록 희석하여 접종하고 18-24시간 37°C 배양기에서 배양한다.
2. 판독방법
   • 가) 시험관리용 well을 먼저 확인하여 양성 대조 및 음성 대조의 증식 여부를 확인 점검한다.
   • 나) 판독 원칙은 세균의 증식이 억제된 well의 농도를 최소억제농도로 판독한다.
   • 다) Trimethoprim-sulfamethoxazole은 80% 억제된 well을 최소억제농도로 판독한다.
   • 라) Trailling end point (Linezolid 등)를 보이는 경우는 trailing이 시작된 첫 번째 well을 판독한다.
   • 마) 중간에 증식이 건너 뛴 well이 있는 경우는 억제가 있는 가장 높은 농도를 보고하고, 2개 이상의 well에서 건너 뛴 경우는 해당 균주를 재실험한다.
     

     | Figure Ⅳ-2 | Linezolid: Trailing End Points (B8-B12, 16-1 ㎍/㎖), MIC=B10
3. 균종별 시험항생제 및 판독기준

   항생제 감수성시험법중 액체배지 미량희석법 균종별 시험항생제, 용량에 따른 판독기준 정보 표

   균종	항생제	판독기준(µg/mL)
   		≥S	I	≤R
   Salmonellaspp.	Ampicillin	8	16	32
   	Cefotaxime	1	2	4
   	Ceftriaxone	1	2	4
   	Ceftazidime	4	8	16
   	Cefoxitin	8	16	32
   	Imipenem	1	2	4
   	Ciprofloxacin	0.06	0.12-0.5	1
   	Nalidixic acid (EUCAST)	NA	NA	NA
   	Amikacin	16	32	64
   	Gentamicin	4	8	16
   	Streptomycin	NA	NA	NA
   	Tetracycline	4	8	16
   	Trimethoprim-Sulfamethoxazole	2/38	NA	4/76
   	Azithromycin (S. Typhi only)	16	NA	32
   	Colistin	2	NA	4
   Shigellaspp.	Ampicillin	8	16	32
   	Cefotaxime	1	2	4
   	Ceftriaxone	1	2	4
   	Ceftazidime	4	8	16
   	Cefoxitin	8	16	32
   	Imipenem	1	2	4
   	Ciprofloxacin	1	2	4
   	Nalidixic acid	16	NA	32
   	Amikacin	16	32	64
   	Gentamicin	4	8	16
   	Streptomycin	NA	NA	NA
   	Tetracycline	4	8	16
   	Trimethoprim-Sulfamethoxazole	2/38	NA	4/76
   	Azithromycin (S. flexneri, ECOFF)	8	NA	16
   	Azithromycin (S. sonnei, ECOFF)	16	NA	32
   	Colistin	2	NA	4